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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ELISA法
更新時間:2011-09-09 點擊量:1553

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ELISA

 

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是分子生物學(xué)技術(shù)中檢測DNAzui靈敏的方法之一,而酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)是免疫學(xué)中zui敏感和特異的檢測方法的代表。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ELISA法(PCR-ELISA)集上述兩方法之精髓,成為繼PCR之后又一個靈敏性更高、特異性更強(qiáng)、省時易行的新方法[7]。根據(jù)生物素和地谷新標(biāo)記底物的不同,PCR-ELISA主要分為兩大類:*類為用生物素和地谷新同時對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記;第二類則是分別對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和核酸雜交探針進(jìn)行標(biāo)記。

生物素和地谷新同時標(biāo)記PCR產(chǎn)物主要有三種途徑:①在PCR反應(yīng)混合物中同時加入生物素和地谷新標(biāo)記的脫氧核苷酸類似物(DIG-Bio-dUTP);②加入生物素化的引物和DIG-dUTP;③加入生物素化引物1和地谷新標(biāo)記的引物2。實驗方法如下:將標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀,或用純化柱除去未結(jié)合的標(biāo)記物,加至親合素包被的酶標(biāo)板孔中孵育1~2h,*洗滌,加抗地谷新抗體,然后加入堿性磷酸酶結(jié)合物底物孵育,終止反應(yīng)后,根據(jù)吸光度(A)值判斷結(jié)果。這類親合素介導(dǎo)的固相捕獲生物素標(biāo)記的靶分子檢測系統(tǒng),靈敏度高于PCR檢測,且操作簡便、快速,重復(fù)應(yīng)用性好,可以在短時間內(nèi)(<4h)準(zhǔn)確檢測大量的臨床標(biāo)本(血清、分泌液或甲醛固定標(biāo)本);通過適當(dāng)調(diào)整PCR循環(huán)次數(shù)及相關(guān)參數(shù)并對多時間點上產(chǎn)量進(jìn)行線性分析,可對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。由于檢測系統(tǒng)是建立在雙標(biāo)記核酸片段上的,有時會出現(xiàn)非特異性PCR產(chǎn)物吸附,引起本底偏高的現(xiàn)象。

第二類PCR-ELISA為生物素和地谷新分別標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和核苷酸探針。用生物素化的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后加入親和素包被的酶標(biāo)板中,冰浴1h,經(jīng)洗滌后加入變性劑(50mmol/L NaOH)室溫作用數(shù)分鐘,加入雜交液和地谷新標(biāo)記的探針,雜交完成經(jīng)洗滌后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地谷新抗體,室溫下作用1h經(jīng)充分洗滌后加顯色劑,讀取A值。該方法利用生物素化引物獲得含生物素的PCR產(chǎn)物,使產(chǎn)物能與包被在酶標(biāo)板上的親和素牢固地結(jié)合,使特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物吸附于酶標(biāo)板上,繼而用地谷新標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交和放大,這一方法特異性強(qiáng),靈敏度高,重復(fù)性好。

PCR-ELISA方法的*性主要表現(xiàn)在以下四個方面。①利用生物素-親和素系統(tǒng)的強(qiáng)大親和能力,其親和常數(shù)K約為抗原抗體的104~107倍,為A蛋白(SPA)IgF。的108倍。生物素和親和素二者高度特異的快速結(jié)合,不易受外界干擾,復(fù)合物十分穩(wěn)定,極少發(fā)生離解,提高了實驗的穩(wěn)定性,縮短了反應(yīng)時間。此外,親和素不含糖基,等電點為pH=6.0,與其他抗原或抗體包被酶標(biāo)板比較,其非特異性吸附顯著減少,靈敏度得到提高。②PCR擴(kuò)增使陽性信號通過擴(kuò)增本身以及地谷新抗原抗體反應(yīng)得到極大程度的放大,從而使檢測的靈敏度進(jìn)一步提高。③PCR-ELISA中尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)移酶的使用,使PCR技術(shù)中交叉污染得以極大程度的控制而不影響檢測效果,基本克服了PCR雜交技術(shù)中由于污染造成的假陽性問題。④標(biāo)記探針的使用,使檢測的特異性進(jìn)一步提高,可以與放射性標(biāo)記的Southern雜交相媲美,且探針的引進(jìn)使其應(yīng)用的范圍增大,比PCR本身在基因多態(tài)性分析、病毒分型、克隆鑒定等方面顯示了其*的優(yōu)勢。另外,非同位素標(biāo)記系統(tǒng)的應(yīng)用又避免了使用同位素帶來的危害,而且整個實驗周期較Southern雜交明顯縮短(約 6h),并且操作簡便,可用于大批量標(biāo)本的同時檢測。當(dāng)然PCR-ELISA方法的建立有一定的要求,其中PCR產(chǎn)物和探針的雜交條件(PCR產(chǎn)物的稀釋度、雜交溫度和時間)與檢測敏感性、特異性有密切關(guān)系。

 

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